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Einleitung
DNA-Chips, Bio-Chips, Microarrays
Design der Sonden
Keimnachweis (Bact ID)
Ergebnisse (Bact ID)
Antibiotikaresistenznachweis (ABR)
Ergebnisse (ABR-Chip)
Ablauf des ABR-Nachweises
Persönliche Eindrücke
Glossar
Verwendete Literatur
Abstract
Danksagung
Impressum

 
 
 

 Antibiotikaresistenznachweis (ABR- ARChip) 

Der ABR-ARChip dient zur genotypischen Bestimmung von Antibiotikaresistenzen. Am Prototyp werden Resistenzen gegen Oxacillin, Kanamycin, Trimethoprim, Streptomycin, Vancomycin, Erythromycin, Ampicillin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Fosfomycin, Gentamycin auf einmal nachgewiesen.

Nach der Isolierung der bakteriellen DNA aus Blut (im Regelfall mit Hilfe von handelsüblichen Laborkits) wird diese in 2 gleich große Mengen aufgeteilt. Rudolf Pichler vom ARCS stellte uns bereits gereinigte DNA mit bekanntem Inhalt zur Verfügung, damit er unser Ergebnis überprüfen konnte und für uns keine Infektionsgefahr bestand. DNA-Isolierung aus Speichel oder Blut hatten wir bereits öfters im Unterrichtsfreifach „Gen- und Biotechnologie“ durchgeführt.
Die Aufteilung der Probe ist nötig, da gleichzeitig 12 DNA-Stücke der 12 Antibiotikaresistenzen in der PCR hochvermehrt werden (Multiplex PCR). Aus technischen Gründen geht dies nicht gleichzeitig in einem Eppendorf-Röhrchen, da u.a. 2 sehr ähnliche Primer nötig sind, die sich gegenseitig hybridisieren und somit kein sinnvolles Ergebnis liefern würden. Ist die Ziel DNA milliardenfach vermehrt, muss diese mit einem Farbstoff gekennzeichnet werden. Dazu wird die fluoreszenzmarkierte Base Cytosin verwendet, die eine spezielle Polymerase benötigt, welche „tolerant“ arbeitet, d.h. eben dieses größere Cytosin einbaut. Für den DNA-Chip wird nur ein Strang der Doppelhelix für die Hybridisierung am Chip benötigt. Gibt man beim Markierungsschritt ausschließlich den reversen Primer hinzu, so wird nur am Zielstrang der Farbstoff eingebaut. Die Proben werden zusammengeführt und anschließend für den Arbeitsschritt am Chip vorbereitet. Ein spezieller Puffer stellt den pH-Wert ein. Eine Art Seifenlösung (SDS) löst die Oberflächenspannung des Wassers, damit die Lösung den Chip benetzen kann. Durch Aufkochen wird die DNA in Einzelstränge denaturiert. Nun wird die Lösung vorsichtig, ohne Luftbläschen, auf den Chip gebracht und für 1 Stunde im Brutschrank inkubiert. Bei dieser hohen Wärmebewegung der DNA ist gewährleistet, dass nur DNA mit der genau passenden Sequenz an den Sonden des Chips hybridisiert. Würden weniger Basen komplementär zur Sonde passen, wären die wenigen Wasserstoffbrückenbindungen zu schwach für eine dauerhafte Bindung. Der Chip wird 3-mal sorgfältig gewaschen. Das entfernt restlos nicht fixierte DNA. Dazu verwendet man spezielle Glasbehälter mit Rührwerk. Nach dem Trocknen werden die Chips gescannt und ausgewertet.


 
DNA-Chips - HBLA Ursprung 2005