Messungen am Massenspektrometer
Massenspektrometrische Analyse der Probe LBE.
Die Proben wurden mit der sogenannten nano-LC/MS/MS Methode analysiert. Hierbei werden die zu analysierenden Proteinbanden aus dem SDS-PAGE Gel ausgeschnitten (siehe Abbildung 3 schwarzer, gestrichelter Kasten) und anschließend mit einem Proteine zerschneidenden Enzym, der Protease Trypsin, verdaut. Diese erzeugt kurzkettige Peptide aus dem langkettigen Protein. Die kurzkettigen Peptide werden anschließend chromatographisch aufgetrennt (nano-LC) und ihre Masse in einem ersten massenspektrometrischen Schritt (/MS/) bestimmt. Danach folgt ein Schritt, bei dem die einzelnen Peptide weiter in noch kleinere Teile fragmentiert werden. Die Masse dieser noch kleineren Teile der Peptide wird daraufhin durch einen zweiten massenspektrometrischen Schritt (/MS) aufgezeichnet. Aus den Massen der kleinen Peptidfragmente kann nun die Aminosäuresequenz der Peptide bestimmt werden. Daraus kann wiederum die Sequenz des Ausgangsproteins
zusammengesetzt werden. Bei der Analyse des Einbaus von nicht-natürlichen Aminosäuren macht man es sich zu Nutze, dass beim Einbau die Masse der einzelnen Peptide des Proteins verändert wird. Dies kommt daher, dass die nicht-natürlichen Aminosäuren andere Massen besitzen als die natürlichen
Aminosäuren, z.B. Methionin: 149,21 Da und Ethionin: 163,24 Da.
Abbildung 4 zeigt die Zusammenfassung der massenspektrometrischen Analyse der Katalase aus der LBE Kultur. Die roten Sterne kennzeichnen die Positionen im Protein, an denen Ethionineinbau nachgewiesen werden konnte. Allerdings ist der Ethioninanteil im Vergleich zum Methioninanteil noch gering (siehe Analysedetails im Anhang). Der Einbaugrad soll nun im weiteren Verlauf des Projekts am Max-Planck-Institut für Biochemie verbessert werden. Hierfür soll als erster Schritt die Katalase in ein plasmidbasiertes Expressionssystem überführt werden, was für Bacillus subtilis im Zusammenhang mit nicht-natürlichen Aminosäuren bisher noch nicht untersucht wurde.
Abbildung 4. Aminosäurepositionen, an denen ein Einbau der nicht-natürlichen Aminosäure Ethionin detektiert werden konnte. Die in der massenspektrometrischen Analyse gefundenen Peptide sind blau unterlegt. Schnittstellen der Protease Trypsin sind schwarz unterstrichen. Methionine sind in der Aminosäuresequenz rot markiert. Methioninpositionen, an denen ein Einbau von Ethionin nachgewiesen werden konnte, sind mit einem roten Stern gekennzeichnet.