1. Auswertung der qRT-PCR
In Abbildung 5 sind die Anzahl der Zyklen auf der X-Achse gegen die relative Fluoreszenz (RFU) auf der Y-Achse für das Zielgen BACE1 aufgetragen.
Für die Auswertung der qRT-PCR für die Zielgene und für die miRNA-107 wurde jeweils ein einheitlicher „Threshold“ festgelegt. Aufgrund dieses
Schwellenwerts ist die Vergleichbarkeit unterschiedlicher PCR-Läufe gegeben. Für jedes Zielgen bzw. die miRNA-107 wurde der Ct-Wert („Cycle-Threshold“)
bestimmt, der jenen Punkt beschreibt, an dem die gemessene Fluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz übersteigt.
Bei der qRT-PCR wird die relative Menge der Zielgene und auch des „Housekeeping Genes“ ACT bestimmt. Dieses dient als Referenzgen. Letzteres ist in jeder Zelle
vorhanden und erlaubt eine Aussage über die eingesetzte Menge an cDNA. Ist weniger Referenzgen vorhanden, so wird auch die Menge des gesuchten Gens weniger sein.
Aufgrund dieser Methode werden etwaige Konzentrationsunterschiede der eingesetzten cDNA ausgeglichen. Wichtig ist nur die Differenz zwischen dem Referenzgen und dem Zielgen.
Um unsere Ergebnisse auswerten zu können, wurde zuerst der Threshold aller Experimente mit gleichen Zielgenen gleichgesetzt und die Ct- Werte wurden berechnet. Die Ct-
Werte von ACT wurden von den Ct- Werten der Zielgene abgezogen (ΔCt- Werte).
Je negativer die ΔCt- Werte sind, umso mehr mRNA der Zielgene ist vorhanden. Höhere Mengen an mRNA wiederum sind ein Hinweis auf erhöhte Expression bzw. Aktivität
der betreffenden Zielgene. Um die relative Expression darstellen zu können, wurde die Formel 2-ΔCt verwendet.
Abbildung 5: Darstellung des qRT-PCR-Diagramms für BACE1
Das Level der Zielgene in den Kontrollzellen wurde mit dem Level der Zielgene in den transfizierten Zellen verglichen. Das BACE1-Level in den Kontrollzellen wurde auf 100% gesetzt und das Level
in den transfizierten Zellen wurde im Verhältnis dazu gesehen. Nachfolgend sind die Ergebnisse für BACE1 von zwei Gruppen von Schülerinnen und Schülern dargestellt.
2. Ergebnisse
In unseren SchülerInnenversuchen funktionierten fünf von sechs Proben, bei denen mittels qRT-PCR das BACE1-Level feststellbar war. Bei einer Gruppe funktionierte die Kontrolle
nicht und daher war keine Berechnung durchführbar.
Bei der ersten Gruppe sank das BACE1-Level auf 55,2% und bei der zweiten Gruppe auf 36,4%, jeweils 24 h nach der Transfektion mit miRNA-107 (siehe Abbildung 6). Bei Vorversuchen mit Zellen,
die 72 h nach der Transfektion mit miRNA-107 isoliert wurden, konnte eine Senkung des BACE1-Levels auf 15,7% beobachtet werden (siehe Abbildung 7).
Abbildung 6: Darstellung der BACE1-Levels in Kontrollzellen und transfizierten Zellen von Gruppen 1 und 2, jeweils 24 Stunden nach der Transfektion mit miRNA-107
Abbildung 7: Darstellung des BACE1-Levels in Kontrollzellen und transfizierten Zellen in Vorversuchen, 72 Stunden nach der Transfektion mit miRNA-107
Die Transfektion mit miRNA-107 führte zu keinen nennenswerten Effekten auf das mRNA-Level von APP, weshalb diese Ergebnisse nicht weiter dargestellt bzw. diskutiert werden.
Ebenso nicht dargestellt sind die Ergebnisse der qRT-PCR ausgehend von miRNA.
BACE1:
BACE1 ist ein Enzym, das durch Spaltungen das Amyloid-Vorläuferproteins APP die Beta-Amyloide „erzeugt“. Die Beta-Amyloide sind bei Alzheimer –PatientInnen die
neurotoxischen Plaques, umgangssprachlich „Verkalkung“ genannt.
Transfektion:
Als Transfektion wird in der Zellbiologie das Einbringen von Fremd-DNA oder RNA in eukaryotische Zellen bezeichnet. Wir brachten die synthetisch hergestellte miRNA 107 mimic ein,
die dann in den Zellen ausreifte und in die Genexpression eingreifen konnte.