Überprüfung der Funktionalität der synthetischen Amylase mittels Stärkeagaroseplattentests.

Um unsere synthetischen Amylasen auch noch auf eine weitere Art zu testen, stellten wir Stärkeagaroseplatten (gelierende Inhaltsstoffe einer Alge vermischt mit Stärkelösung) her.

Herstellung der Stärkeagaroseplatten (laut Dr. Eduard Taufratzhofer, Zuckerforschung Tulln):

Man benötigt 11,5 g Nähragar, 10 g Kartoffelstärke und 500 ml destilliertes Wasser. Das Gemisch wird autoklaviert und anschließend vor dem Abkühlen unter einer Reinraumbank in sterile Petrischalen gefüllt.

Die Probelösungen wurden in 3-4 Löcher gefüllt, die mit Hilfe eines Apfelentkerners aus den Agaroseplatten ausgestochen wurden. Nach 5 Stunden Inkubationszeit bei 37°C wurden die Platten mit Gram's Iodreagenz gefärbt. Das Iod band sich an die Stärkekomplexe, wodurch nur stärkehältige Flächen eine dunkelviolette Farbe annahmen. Nach einer kurzen Einwirkzeit wurde das Reagenz wieder abgegossen und mit destilliertem Wasser

abgespült. Je nach Aktivität der aufgetragenen Amylaseproben blieben verschieden große, kreisförmige "Höfe" um die Löcher farblos, da die Amylase hier die Stärke bereits zu Glukose abgebaut hatte. Man konnte anhand der unterschiedlichen Größen der Kreise mit freiem Auge leicht feststellen, ob bzw. wie aktiv die einzelnen Amylaseproben im Vergleich waren. Neben unseren synthetischen Amylasen haben wir auch noch eine kommerzielle Variante, die in der stärkeverarbeitenden Industrie verwendet wird, getestet und qualitativ verglichen.

Einzelne viel zu klein oder viel zu groß geratene Kreise hätten es notwendig gemacht, den Versuch mit einer optimierten Verdünnung zu wiederholen.

Die Ergebnisse sind ein weiterer Beweis, dass die Amylase 2.0 gut funktioniert.

Auf diesem Bild sind die farb- bzw. stärkelosen Ringe rund um die Löcher deutlich erkennbar. Das linke obere Loch verwendeten wir als Blindprobe, so konnten wir sicher gehen, dass wirklich unsere Amylase in den Proben aktiv arbeitete und es keine Kontamination gab. Diese Platte zeigt ein sehr erfreuliches Ergebnis, da wir in jedes der drei Löcher eine andere Probe (LBE, M9E, LBN) mit unserer synthetischen Amylase eingefüllt haben und jede von ihnen eine deutliche Aktivität aufweist.

Diese Abbildung zeigt den deutlichen Unterschied einer Probe (LBE) bei zwei verschiedenen Konzentrationen. Die Probe im oberen Loch wurde stärker verdünnt als die im unteren. Das rechte Loch ohne Ring wurde nicht befüllt und diente wieder als Blindprobe.

In diesem Bild ist gut zu erkennen, welche Auswirkung die Temperatur auf die Wirkung eines Enzyms hat. Die linke Platte wurde bei 37 °C inkubiert, die rechte nur bei 20 °C. In jedes Loch wurden die Proben (M9E) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen pipettiert. Auf beiden Platten wurden dieselben Konzentrationen in die jeweiligen Löcher pipettiert. Bei der linken Platte wurde das rechte obere

Loch nicht befüllt, da wir aus vorherigen Versuchen bereits wussten, dass diese Verdünnung bei gegebener Temperatur einen zu großen Kreis bildet. Dieser hätte wiederum die Auswertung der anderen Proben auf derselben Platte gestört. Es ist gut zu erkennen, dass die Ringe der linken, wärmer inkubierten Platte deutlich größer sind. Das heißt, bei 37°C ist die Amylase deutlich aktiver als bei 20°C.