Auswertung mittels Proteingelen (SDS-Gele)

1. Auftritt von Katalase im Kulturmedium

Abbildung 1. Katalase Expression während des Bacillus-subtilis-Wachstums. Es wurden Kulturüberstände von Bacillus subtilis zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Wachstumsphase entnommen. Die Nummern der einzelnen Spuren geben den Zeitpunkt der Probennahme (in Stunden) nach der Kulturinokulation an. Beachten Sie das Auftreten der Katalase mit zunehmender Kulturzeit (rot gestrichelter Kasten). S (Standard): Fermentas Prestained protein marker (#Sm0671), Auftragsmenge: 5µl; M9M: Bacillus subtilis Kultur, Medium: Minimalmedium M9, Zugegebene Aminosäure: Methionin; LBM: Bacillus subtilis Kultur, Medium: Vollmedium LB, Zugegebene Aminosäure: Methionin; LBN: Bacillus subtilis Kultur, Medium: Vollmedium LB, Zugegebene Aminosäure: Norleucin. Es wurden jeweils 32 µl Kulturüberstand auf das Gel aufgetragen (+ 8 µl 5 x SDS Auftragspuffer).

In den drei beispielhaft angegebenen Kulturen M9 mit Methionin, LB mit Methionin und LB mit Norleucin ist ein Auftreten d er Katalase zwischen 7 und 20 Stunden nach der Kulturinokulation deutlich zu beobachten (siehe Abbildung 1, rotgestrichelter Kasten).

Abbildung 2. Katalaseexpression nach 21 Stunden. Es wurden die Bacillus-subtilis-Kulturüberstände nach Ende der Expressionszeit aufgetragen. S (Standard): Fermentas Prestained protein marker (#Sm0671), Auftragsmenge: 5µl; LB: Vollmedium LB; M9: Minimalmedium M9; M: Methionin; E: Ethionin; N: Norleucin. Es wurden jeweils 20µl Kulturüberstand auf das Gel aufgetragen (+ 5 µl 5 x SDS Auftragspuffer).

Nach Abschluss der Katalaseexpression wurden zum Vergleich alle Kulturüberstände auf ein Gel aufgetragen. Katalase war in allen Proben vorhanden (siehe Abbildung 2, rotgestrichelter Kasten). Vergleicht man den Gesamtproteingehalt der sechs Proben so zeigt sich, dass alle Kulturüberstände in etwa gleich viel Protein enthielten. Daraus kann gefolgert werden, dass die Bandenintensitäten der Katalase in den einzelnen Proben direkt miteinander verglichen werden können.
Gleiche Mengen an Katalase sind einerseits in den Überständen LBN, M9M, M9E und M9N und andererseits in den Überständen LBM und LBE enthalten. Vergleicht man die zwei Gruppen an Überständen untereinander, enthalten LBM und LBE ca. dreimal soviel Katalase wie LBN, M9M, M9E und M9N.
Zur näheren Untersuchung wurde die Katalase aus den Kulturüberständen weiter aufgereinigt.

2. Aufreinigung der Katalase

Abbildung 3. Zweistufige Ammoniumsulfatfällung der Katalase. S (Standard): Fermentas Prestained protein marker (#Sm0671), Auftragsmenge: 5µl; M9E: Bacillus subtilis Kultur, Medium: Minimalmedium M9, Zugegebene Aminosäure: Ethionin; LBE: Bacillus subtilis Kultur, Medium: Vollmedium LB, Zugegebene Aminosäure: Ethionin; Ü1: Überstand der Kultur; P1: Präzipitat bei Ammoniumsulfatzugabe zu 50 %; P2: Präzipitat bei Ammoniumsulfatzugabe zu 80 %; D1: Dialysat von Präzipität P1; D2: Dialysat von Präzipität P2. Es wurden jeweils 20 µl Kulturüberstand auf das Gel aufgetragen (+ 5µl 5 x SDS Auftragspuffer). In einer ersten Stufe wurden die Überstände (siehe Abbildung 3, Ü1) zu einer

Endkonzentration von 50% mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Präzipitat (P1, siehe Abbildung 3) wurde durch Filtration abgetrennt. Zum erhaltenen zweiten Überstand wurde weiteres Ammoniumsulfat zu einer Endkonzentration von 80% zugegeben. Das Präzipitat (P2, siehe Abbildung 3) wurde durch Filtration abgetrennt. P1 und P2 wurden anschließend in 10 ml Trispuffer resuspendiert und über Nacht bei 4°C gegen Trispuffer dialysiert (Dialysate D1 und D2, siehe Abbildung 3). Abbildung 3 zeigt die Aufreinigung exemplarisch für die Kulturüberstände M9E und LBE.
Durch den ersten Schritt der Ammoniumsulfatfällung (Präzipitate P1) konnten kontaminierende Proteine aus der Probe entfernt werden. Vor allem das im Überstand (Ü1) am stärksten auftretende Protein bei ca. 37 kDa konnte fast gänzlich entfernt werden (siehe schwarze Pfeile in Abbildung 3).
Die Katalase konnte durch die weitere Zugabe von Ammoniumsulfat aus dem Kulturüberstand ausgefällt werden (siehe rote Pfeile in Abbildung 3). Durch die anschließende Dialyse wurde die Katalase wieder in Lösung gebracht (siehe Dialysate D2 in Abbildung 3).
Vergleicht man das Verhältnis von Katalase zu Gesamtprotein in Ü1 und D2 lässt sich feststellen, dass die Katalase durch die zweistufige Ammoniumsulfatfällung gegenüber den anderen Proteinen im Kulturüberstand stark aufkonzentriert wurde.

Die Dialysate D2 wurden in der Folge für weitere Analysen herangezogen. Aus Zeitgründen konnte bis zur Fertigstellung dieses Berichts nur die massenspektrometrische Analyse der Proben LBE durchgeführt werden.