Erlernte Methoden
Expressionstest:
Wir führten mit einem Barstar-Modellprotein einen Expressionstest durch. Barstar ist ein kleines Protein, synthetisiert von Bacillus amyloliquefaciens. Dieses Protein wurde zuvor von Miche schon vorbereitet, indem er ein Stoppcodon in seine Sequenz eingebaut hat. Durch den Einbau der synthetischen Aminosäure P-Benzoyl-L-Phenylalanin (Bpa) könnte dieses Stoppcodon überlesen werden.
Erwartung:
Wenn die Expression richtig funktioniert - das würde bedeuten dass das Stoppcodon überlesen und an seiner Stelle Bpa eingebaut wird - muss eine Bande bei ca. 10 kDa erscheinen.
Durchführung:
Picken von Einzelkolonien und Ansetzen einer Flüssigkultur
Kontrolle des Wachstums durch Messen von OD bei 600 nm
wenn OD-Wert bei ca. 0.6, Induktion der Proteinexpression mit IPTG
Ernte der Zellen nach 4.5 h Expression bei 30 °C
Ergebnis:
Auf dem Gel ist keine Bande bei 10 kDa sichtbar. Folglich wurde das Stoppcodon nicht überbrückt und auch die synthetische Aminosäure Bpa nicht eingebaut.
Expressionsgel von Barstar. S1/2: Proteinstandardmarker (5 µl); C1– C3: Expressionsklone 1- 3 (0.15 OD). 17 % SDS Gel.
Reinigung von GFPuv:
Bei der His-Tag-Methode wird die DNA-Sequenz des zu isolierenden Proteins um die Codons eines His-Tags (His-Linker, bestehend aus sechs Histidinresten) ergänzt. Dieser His-Tag bindet spezifisch an ein Säulenmaterial mit zweiwertigen Nickel-Ionen. Diese Spezifität gewährleistet, dass nur das Fusionsprotein an das Säulenmaterial bindet.
Erwartung:
Mittels der His-Tag-Methode soll es gelingen, das GFPuv effektiv aufzureinigen.
Durchführung:
Aufschließen der Zellen mittels Ultraschall
Abzentrifugieren der Zellbestandteile
Vorbereiten der Nickel-Säule
Aufreinigung des Proteins aus dem Lysat (Binden des Proteins, Elution des Proteins)
Messung der Proteinkonzentration
Vorbereitung der Probe für die Massenspektrometrie
Fluoreszenz und UV Spektrum messen
Im Massenspektrometer wurde die genaue Masse des aufgereinigten Proteins bestimmt. Anhand des folgenden Graphen ist ersichtlich, dass das GFP eine Masse von 28014 kDa hat.
Ergebnis:
Das 1. Foto des SDS-Gels wurde unter UV-Licht gemacht, hier sind die Banden kaum zu erkennen. Für das 2. Foto wurden die Proteine
eingefärbt. S: Standard Proteinmarker (5µl), P: Zellpellet; D: Durchfluss; W 1-3: Waschgang 1-3; GFP: aufgereinigtes Protein/GFP.
Auf dem 2. Bild kann man deutlich sehen, wie viele Proteine verschiedener Länge bereits bei dem Durchfluss und 1. Waschgang abgeschieden wurden.
Beim 2. und 3. Waschgang war die Säule schon gesättigt, weshalb sich in den Waschlösungen auch geringe Mengen des GFPs befinden. Dies ist
an den zwei Banden mit 25 kDa zu erkennen, welche auf gleicher Höhe mit der des aufgereinigten GFPs sind. Die dicke Bande in der Spalte GFP zeigt,
dass die Aufreinigung gut funktioniert hat.
Aufreinigung von Plasmid- DNA/ Restriktionsverdau:
Erwartung:
Sauber aufgereinigte Plasmid- DNA und Banden mit der richtigen Größe am DNA-Gel.
Durchführung:
Zellpellet lösen
Zellen werden chemisch aufgeschlossen, durch Zugabe eines weiteren Puffers fallen Kohlenhydrate, Proteine, etc. aus
durch Zentrifugieren kann die gelöste DNA ohne ausgefallenen Stoffen direkt in eine vorbereitete Säule überführt werden
nach dem Equilibrieren wird die DNA mit Isopropanol und Ethanol gewaschen
die getrocknete DNA wird in Wasser gelöst
mittels Nanotrop kann die Konzentration ermittelt werden
Restriktionsverdau
auf DNA-Gel auftragen
Ergebnis:
Es ist bei jeder Probe eine deutliche Bande zu erkennen. Bei den Proben 3, 4 und 5 hat das Restriktionsenzym zweimal geschnitten, was man an den zwei Banden je Reihe ablesen kann(bei 4500 und 800 bp).
Transformation eines Shuttlevektors in Bacillus subtilis:
Erwartungen:
Der Bacillus-subtilis–Stamm, bei welchem das Gen zur Amylaseproduktion "ausgeschaltet" wurde, sollte einen Shuttlevektor mit Amylasegen aufnehmen und so wieder zur Amylaseproduktion angeregt werden.
Durchführung:
die Bacillus-subtilis-Kultur wir angesetzt
bevor die Zellen die stationäre Phase erreichen, werden sie geerntet (nach 5 h)
einem Teil der Zellen wird EDTA beigemengt (fördert eine spätere Aufnahme der Vektoren)
Plasmide werden dazugegeben (nach zwei Stunden bei 37 °C im Schüttler sollten die Zellen die Plasmide aufgenommen haben und somit auch antibiotikaresistent sein)
die Zellen werden auf eine Platte aufgestrichen, über Nacht müssen sich Kolonien bilden
Ergebnis:
In folgendem Diagramm ist das Wachstum der Zellen dargestellt:
Auf den Platten bildeten sich keine Kolonien, folglich wurde der Vektor nicht aufgenommen und die Zellen waren somit nicht antibiotikaressistent. Ein möglicher Grund könnte sein, dass wir EDTA verwendet haben und nicht EGTA, wie es im Protokoll steht.