Ergebnisse

Um zu bestimmen, ob es sich bei dem von unserer Bacillus subtilis-Kultur erzeugten Enzym auch tatsächlich um eine echte Katalase handelte (bzw. ob diese wirklich synthetische Aminosäuren in ihre Struktur integriert hatte) waren weitere Untersuchungsschritte notwendig.

Die erste, noch relativ einfache Analyse der Zellüberstände und der darin gelösten Proteine, die das Bakterium während seiner Wachstumszeit erzeugt hatte, wurde mittels eines SDS-Proteingels durchgeführt. Durch den nicht all zu großen Materialaufwand konnten wir diesen Versuch selbst, in unserem Schullabor, durchführen. Die dafür benötigten Acrylamid-Gelplatten stellte uns dennoch das Max-Planck-Institut zur Verfügung, da die Herstellung in einer Schülergruppe aufgrund der stark toxischen Wirkung des Acrylamids nicht ganz ungefährlich gewesen wäre.

20 µl der zu untersuchenden Probe (gesammelte Zellüberstände, Präzipitate und Dialysate) wurden mit 5 µl des SDS-Probenpuffers versetzt, die Flüssigkeit durchmischt und mittels kurzen Abzentrifugierens in der Spitze des Eppendorfergefäßes gesammelt. Anschließend erfolgte eine fünfminütige Inkubation bei 95°C. Dabei lagerte sich der stark lipophile (= fettliebende = wasserhassende) Teil des Sodium-dodezylsulfates (SDS) an die Oberfläche eines jeden Eiweißes an. Da sich in der wässrigen Lösung die Ionenbindung löste erhielt das gesamte Dodezylsulfat eine negative Ladung und damit auch das daran haftende Eiweiß. Die Lösung (mit den nun negativ geladenen Proteinen) wurde nochmals durchmischt, abzentrifugiert und auf das Gel aufgetragen. Jetzt wurde für zwei Stunden eine 130 V Spannung angelegt. Die dabei unten entstehende positive Ladung übte eine Anziehungskraft auf die negativ geladenen Eiweiße aus. Diese wurden nun -

abhängig von ihrer Größe - mehr oder weniger stark auf dem Weg durch das Gel gebremst und dementsprechend aufgetrennt. Sobald die Lauffront den unteren Bereich des Gels erreicht hatte wurde die Spannung abgeschaltet, das Gel von den Trägerplatten entfernt, eingefärbt und wieder entfärbt. Auf dem Leuchttisch konnte man nun gut die Banden der nach ihrer Größe aufgespaltenen Proteine sehen. Mit Hilfe des an beiden Seiten aufgetragenen Markers, dessen Banden standardisiert durch das Gel mitwanderten, konnte man die Masse in kDa (Kilodalton) gut abschätzen. Erfreulicherweise stellte sich heraus, dass bei allen untersuchten Proben eine deutliche Bande auf der Höhe der 55 KDa Marke zu erkennen war - was der Größe der von uns gesuchten Katalase entsprach.

Jedoch war dieses Ergebnis noch kein Beweis dafür, dass es sich bei dem gefundenen Protein tatsächlich um Katalase handelte und nicht um ein Eiweiß gleicher Größe. Dies war zwar unwahrscheinlich, wäre aber durchaus möglich gewesen. Schon gar nicht hatte das SDS Gel Aufschluss gegeben, ob in die Katalase die nicht-kanonischen Aminosäuren Ethionin bzw. Norleucin eingebaut worden waren.

Um dies herauszufinden, bedurfte es einer massenspektrometrischen Untersuchung. Da die dafür benötigten Gerätschaften jedoch deutlich über unserem Budget lagen (und für die Untersuchung außerdem eine ausgebildete Fachperson unerlässlich war), übernahm das Max-Planck-Institut diese Analyse für uns.

Um einen Stoff massenspektrometrisch zu untersuchen, durchläuft seine

Probe mehrere komplizierte Schritte: Zunächst wird das Analyt durch verschiedenste Methoden ionisiert. Das heißt, es wird teilweise in seine Bestandteile zerlegt, denen Elektronen aus der Hülle entfernt werden, worauf sie eine positive Ladung annehmen. Wie stark diese Ladung ist hängt von mehreren Faktoren ab und dient zur Bestimmung des Stoffes. Anschließend werden die Ionen ähnlich wie beim Verfahren der Chromatographie, jedoch nach ihrem Masse-Ladung-Verhältnis aufgetrennt. Daraufhin erfolgt die Messung der aufgespaltenen Ionenpakete. Diese bewegen sich nacheinander über eine Detektorenplatte, die ihre Ladung feststellt und als sogenannte Peaks festhält.

Um das massenspektrographische Ergebnis auswerten zu können ist es nötig, die Ladungen der einzelnen Ionen zu kennen. So kann die Anzahl der Ionen einer Größe anhand der gemessenen Ladung ermittelt werden.

Das heißt: Wenn Größe und Ladung der von uns gesuchten synthetischen Aminosäure bekannt sind, so kann mithilfe der massenspektrometrischen Analyse bestimmt werden, ob und wie oft die gewünschte Manipulation des Enzyms vorliegt. Man erhält die genaue Aminosäurenkette und sieht, an welcher Stelle ein Austausch mit nicht-kanonischen Aminosäuren geklappt hat.